三氧化二砷或/和硫酸铜通过破坏线粒体动力学并激活细胞凋亡和细胞自噬诱导鸡腺胃损伤

新和盈解读：

鸡腺胃是由粘膜下腺体组成的复杂系统，含外分泌细胞可分泌胃液和胃酸的发酵物，以防止胃液和摄入物质对腺胃的不利影响。肉鸡腺胃一旦受损，其生长性能可能会降低。虽然已有大量科研人员对三氧化二砷和(或)硫酸铜的毒理学进行研究，但尚未见到其对鸡腺胃影响的报道，本文从线粒体动力学、细胞凋亡和细胞自噬的角度阐明了三氧化二砷和(或)硫酸铜对鸡腺胃的毒性及潜在机制。希望对您和行业有所帮助。

Arsenic trioxide or/and copper sulfate co-exposure induce glandular stomach of chicken injury via destruction of the mitochondrial dynamics and activation of apoptosis as well as autophagy

三氧化二砷和(或)硫酸铜通过破坏线粒体动力学并激活细胞凋亡和细胞自噬诱导鸡腺胃损伤

Mengyao Mu¹, Hongjing Zhao, Yu Wang, Juanjuan Liu, DongxueFei, Mingwei Xing∗

（广东新和盈生物科技有限公司摘译）

主要结果：

与对照组相比，日粮单独或同时添加三氧化二砷和硫酸铜可导致细胞核固缩、染色质凝缩、线粒体肿胀空泡化，形成嵴折，影响线粒体DNA转录过程；日粮添加300mg/kg的硫酸铜组蛋鸡腺胃中可观察到细胞凋亡，且在细胞凋亡检测中发现日粮中同时添加三氧化二砷和硫酸铜可极显著升高蛋鸡腺胃的凋亡细胞数量；日粮中添加30mg/kg三氧化二砷+300mg/kg硫酸铜组中可观察到腺胃细胞核膜受损并溶解，细胞发生自噬现象。说明日粮添加三氧化二砷和硫酸铜对蛋鸡腺胃线粒体发育有不利影响。

与对照组相比，日粮中添加三氧化二砷可极著下调4周龄蛋鸡腺胃核基因Opa1mRNA表达量，极显著下调8周龄和12周龄蛋鸡腺胃中核基因Opa1基因、线粒体融合蛋白1和线粒体融合蛋白2 mRNA表达量，显著上调12周龄蛋鸡腺胃线粒体动力相关蛋白1mRNA表达量；极显著上调4周龄蛋鸡腺胃介导细胞凋亡的Fas基因mRNA的表达量，极显著上调8和12周龄蛋鸡腺胃介导细胞凋亡的Caspase8、Bax、Bax/Bcl-2、Cyt c、Caspase9、Caspase3基因mRNA的表达量，显著下调8和12周龄蛋鸡腺胃Bcl-2基因 mRNA相对表达量；硫酸铜对腺胃线粒体动力学和细胞凋亡相关基因的影响与三氧化二砷相似；日粮添加三氧化二砷+硫酸铜可极显著上调12周龄蛋鸡腺胃线粒体动力相关蛋白1的mRNA相对表达量，极显著下调4、8、12周龄蛋鸡腺胃核基因Opa1、线粒体融合蛋白1和线粒体融合蛋白2的 mRNA相对表达量；且与其它组相比，日粮中三氧化二砷+硫酸铜组线粒体动力学相关基因和细胞凋亡基因的影响程度最大。说明日粮添加三氧化二砷和硫酸铜促进了蛋鸡腺胃线粒体裂变和细胞的凋亡、降低了线粒体细胞的融合和线粒体间的相互联系，导致线粒体细胞损伤，且这种不利影响会随着蛋鸡日龄的增加加剧三氧化二砷和硫酸铜对腺胃细胞的损伤。并从蛋白表达水平证实了三氧化二砷和硫酸铜对线粒体动力学和细胞的不利影响。

与对照组相比，日粮添加三氧化二砷可极显著上调8和12周龄蛋鸡自噬相关基因Becline1、ATG5、ATG4B基因mRNA的表达量，极显著上调自噬标志物LC3-II/I mRNA表达量之比，极显著降低了试验期间蛋鸡腺胃mTOR基因mRNA相关表达量；同样日粮添加硫酸铜组和三氧化二砷+硫酸铜组，极显著上调了4、8、12周龄蛋鸡自噬相关基因Becline1、ATG5、ATG4B基因mRNA的表达量，极显著上调了4周龄蛋鸡腺胃自噬标志物LC3-II/I mRNA表达量之比，极显著上调了8和12周龄蛋鸡腺胃自噬标志物LC3-II/I mRNA表达量之比，极显著下调了试验期蛋鸡腺胃mTOR基因mRNA相关表达量。说明日粮添加三氧化二砷和硫酸铜可降低腺胃细胞的生长和增殖同时可促进腺胃细胞的自噬，且这种不利影响会随着蛋鸡日龄的增加加剧三氧化二砷和硫酸铜对腺胃细胞的损伤。并从蛋白表达水平证实了三氧化二砷和硫酸铜对腺胃的发育有不利影响。

方法与材料：

试验选取72只雄性1日龄海兰褐壳蛋鸡（Hy-Line），随机分为4组，每组18个重复。分别为对照组饲喂基础日粮（C组）、基础日粮+30 mg/kg三氧化二砷组（As组）、基础日粮+300 mg/kg硫酸铜组（Cu组）和基础日粮+30 mg/kg三氧化二砷+300 mg/kg硫酸铜铜组（AsCu组）。试验期间舍内12光照昼夜更替，自由采食饮水。试验共计12周，在第4、8、12周分别选取6只蛋鸡麻醉安乐死，采腺胃置于-80℃保存备用。对鸡腺胃进行染色进行组织学观察、TUNEL分析进行细胞凋亡检测和实时荧光定量PCR等分析。

主要图表说明：

图1 三氧化二砷和硫酸铜对12周龄蛋鸡腺胃组织形态学的影响

1）日粮添加三氧化二砷和硫酸铜组（图B-H）蛋鸡腺胃出现细胞核固缩、线粒体肿胀、细胞膜溶解现象。

2）A、E为对照组；B、F为日粮添加三氧化二砷组；C、G为日粮添加硫酸铜；D、H为日粮添加三氧化二砷+硫酸铜组

3）图B-G红色箭头为细胞核固缩（表现为核缩小、凝聚，提示DNA转录停止）和染色质凝缩,图D-H红色箭头表示细胞核膜的损伤和溶解；绿色箭头为嵴折；黄色箭头为凋亡细胞；蓝色箭头为细胞自噬示意图。

图212周龄蛋鸡腺胃TUNEL染色图

1）日粮添加三氧化二砷和硫酸铜促进了蛋鸡腺胃细胞的凋亡

2）左图中细胞核为蓝色为正常细胞，棕褐色为凋亡细胞

3）左图中A为对照组；B为日粮添加三氧化二砷组；C为日粮添加硫酸铜；D为日粮添加三氧化二砷+硫酸铜组；E为线粒体损伤评分表，C为对照组；As为日粮添加三氧化二砷组；Cu为日粮添加硫酸铜；AsCu为日粮添加三氧化二砷+硫酸铜组

4）Apoptotic index:细胞凋亡指数；*：差异显著P＜0.05；**：差异极显著P＜0.01；#：差异显著P＜0.05。

图3 日粮添加三氧化二砷和硫酸铜对4、8、12周龄蛋鸡腺胃线粒体动力学相关基因mRNA的影响

1)从基因转录水平可知，日粮添加氧化二砷和硫酸铜可促进线粒体的裂变和降低线粒体的膜融合，对线粒体发育有不利影响。

2）C：对照组；As：日粮添加三氧化二砷组；Cu：日粮添加硫酸铜；AsCu：日粮添加三氧化二砷+硫酸铜组。

3）Relative Drp1 mRNA level：线粒体动力相关蛋白1mRNA相对表达量（线粒体动力相关蛋白1形成螺旋寡聚体，包裹线粒体外膜并将其分裂）；RelativeOpa1 mRNA level：Opa1基因mRNA相关表达量（Opa1基因属于核基因，编码的蛋白是线粒体内源发动蛋白，是线粒体塑形蛋白家族的成员，参与线粒体内膜融合，对线粒体形态结构有着重要的作用）；Relative Mfn1 mRNA level：线粒体融合蛋白1 mRNA相对表达量；Relative Mfn2 mRNA level ：线粒体融合蛋白2 mRNA相对表达量。

4）*：差异显著P＜0.05；**：差异极显著P＜0.01；#：差异显著P＜0.05。

表4 日粮添加三氧化二砷和硫酸铜对4、8、12周龄蛋鸡腺胃细胞凋亡相关基因mRNA的影响

1）从基因转录水平可知，日粮添加三氧化二砷和硫酸铜可促进细胞的凋亡。

2）C：对照组；As：日粮添加三氧化二砷组；Cu：日粮添加硫酸铜；AsCu：日粮添加三氧化二砷+硫酸铜组。

3）Relative Fas mRNA level：Fas基因mRNA相对表达量（Fas可介导细胞的凋亡）；Relative Caspase8 mRNA level：Caspase8基因mRNA相关表达量（Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着重要作用）；Relative P53 mRNA level： P53 mRNAmRNA相对表达量（p53具有促进细胞凋亡的功能）；Relative Bax mRNA level ：Bax基因mRNA相对表达量（bax基因是人体最主要的凋亡基因，属于Bcl-2 基因家）；Relative Bcl-2 mRNA level：Bcl-2基因 mRNA相对表达量；Relative Bax/Bcl-2 mRNA level：Bax/Bcl-2基因mRNA之比的相对表达量（Bax/Bcl-2 两蛋白之间的比例关系是决定对细胞凋亡抑制作用强弱的关键因素）；Relative Cyt c mRNA level：细胞色素c基因mRNA相对表达量；Relative Caspase9 mRNA level：Caspase9基因mRNA相对表达量；Relative Caspase3 mRNA level：Caspase3基因mRNA相对表达量。

4)*：差异显著P＜0.05；**：差异极显著P＜0.01；#：差异显著P＜0.05。

图5A图为日粮添加三氧化二砷和硫酸铜对肉鸡腺胃线粒体动力学和细胞凋亡相关基因蛋白表达水平图；B图为日粮添加三氧化二砷和硫酸铜对肉鸡腺胃线粒体动力学和细胞凋亡相关基因蛋白表达的定量分析图

1）从蛋白表达水平证实，日粮添加三氧化二砷和硫酸铜可降低线粒体的裂变和融合，并促进腺胃细胞的凋亡。

2）C：对照组；As：日粮添加三氧化二砷组；Cu：日粮添加硫酸铜；AsCu：日粮添加三氧化二砷+硫酸铜组。

3）Opa1 protein/β-action radio： Opa1蛋白的相对表达；Mfn1 protein/β-action radio：Mfn1蛋白的相对表达量；；Mfn2 protein/β-action radio： Mfn2蛋白的相对表达量；P53 protein/β-action radio： P53蛋白的相对表达量；Bax/Bcl-2 protein/β-action radio：Bax/Bcl-2蛋白的相对表达量之比；Caspase3/β-action radio：Caspase3蛋白的相对表达量；

4） *：差异显著P＜0.05；**：差异极显著P＜0.01；#：差异显著P＜0.05。

表6 日粮添加三氧化二砷和硫酸铜对4、8、12周龄蛋鸡腺胃细胞自噬相关基因mRNA的影响

1）由基因表达水平可知，日粮添加三氧化二砷和硫酸铜可促进腺胃细胞的自噬，对腺胃的发育有不利影响。

2）C：对照组；As：日粮添加三氧化二砷组；Cu：日粮添加硫酸铜；AsCu：日粮添加三氧化二砷+硫酸铜组

3）Relative Becline1 mRNA level：Becline1 mRNA相对表达量（自噬蛋白基因）；Relative mTOR mRNA level：mTOR基因mRNA相关表达量（它是细胞生长和增殖的重要调节因子）；Relative ATG5 mRNA level： ATG5 mRNA相对表达量（自噬相关蛋白基因）；Relative ATG4B mRNA level ： ATG4B mRNA相对表达量；Relative LC3-II/I mRNA level ： LC3-II/ImRNA相对表达量之比（LC3是细胞自噬的标志物）；

4）*：差异显著P＜0.05；**：差异极显著P＜0.01；#：差异显著P＜0.05。

图7 A图为日粮添加三氧化二砷和硫酸铜对肉鸡腺胃自噬相关基因蛋白表达水平图；B图为日粮添加三氧化二砷和硫酸铜对肉鸡腺胃自噬相关基因蛋白表达的定量分析图

1）从蛋白表达水平证实，日粮添加三氧化二砷和硫酸铜可促进腺胃细胞自噬，对腺胃的发育有不良影响。

2）C：对照组；As：日粮添加三氧化二砷组；Cu：日粮添加硫酸铜；AsCu：日粮添加三氧化二砷+硫酸铜组。

3）Beclin1 protein/β-action radio：Beclin1蛋白的相对表达；mTOR protein/β-action radio：mTOR蛋白的相对表达量；ATG5 protein/β-action radio：ATG5蛋白的相对表达量；ATG4B protein/β-action radio：ATG4B蛋白的相对表达量；LC3-II/I protein/β-action radio：LC3-II/I蛋白的相对表达量之比；

4）*：差异显著P＜0.05；**：差异极显著P＜0.01；#：差异显著P＜0.05。

翻译：张倩玉、张罕星                          校对：林映才                          排版：张明然、刘立

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