嗜热裂解酶融合蛋白靶向作用产气荚膜梭菌

新和盈解读：

细胞裂解酶的CAT结构编码的内肽酶、糖苷酶和酰胺酶，可靶向作用产气荚膜梭菌细胞壁上的肽聚糖结构中的不同连接键裂解细胞，杀死产气荚膜梭菌。本试验筛选了嗜热地衣芽孢杆菌含有裂解酶CAT结构域DNA序列和不同产气荚膜梭菌裂解酶CWB结构域DNA序列进行聚合酶链式反应，通过基因克隆技术制备重组裂解酶，该酶展现出良好的耐高温和对产气荚膜梭菌的抑菌作用。希望对您和行业有所帮助。

Thermophile Lytic Enzyme Fusion Proteins that Target Clostridium perfringens

嗜热裂解酶融合蛋白靶向作用产气荚膜梭菌

主要结果：

1）与对照组相比，Y412_CAT(来源于地芽胞杆菌基因组Y412MC61)、Y4_CAT(来源于地芽胞杆菌基因组Y4.1MC1)和GVE2_CAT(来源于深海嗜热噬菌体E2)与不同产气荚膜梭菌的CWB结构域（包括菌株CP10_CWB、CP18_CWB、CP33_CWB、CP41_CWB和CP26F_CWB）重组裂解酶，对不同的产气荚膜梭菌菌株（Cp39、Cp509、Cp734、CpJGS1504、CpJGS1659）表现出不同程度的裂解作用；其中GVE2_CAT-CP33_CWB和 GVE2_CAT-CP41_CWB、Y412_CAT-CP18_CWB和Y412_CAT-CP33_CWB重组裂解酶对所有测试的产气荚膜梭菌有良好的裂解作用。说明：重组裂解酶可起到裂解杀灭产气荚膜梭菌的作用。

2）天然产气荚膜梭菌菌株Cp18裂解酶（PlyCP18）热稳定性较差，在60℃均已失活。但与PlyCP18相比，Y412_CAT重组裂解酶和GVE2_CAT重组裂解酶在60℃仍有一定的留存率，其中Y412_CAT-CP26F_CWB和GVE2_CAT-CP26F_CWB在70℃和80℃仍有一定的酶活，甚至GVE2_CAT-CP41_CWB重组裂解酶在90℃仍有留存率。表明：重组裂解酶具有一定的热稳定性，耐高温。

3）除Y4_CAT-CP26F_CWB裂解酶对产气荚膜梭菌菌株CP39、CP734、CPJGS1504、CPJGS1659无抑菌作用外，GVE2_CAT、Y4_CAT和Y412_CAT与不同产气荚膜梭菌CWB结构域重组裂解酶均可抑制产气荚膜梭菌菌株（CP39、CP509 、CP734、CPJGS1504、CPJGS1659）的生长。且GVE2_CAT和Y412_CAT重组裂解酶对产气荚膜梭菌的抑菌效果更佳。

重组裂解酶GVE2_CAT-CP33_CWB、GVE2_CAT-CP41_CWB的最小抑菌浓度大于100 μg/mL， YY412_CAT-CP33_CWB、YY412_CAT-CP41_CWB的最小抑菌浓度为100 μg/mL，Y4_CAT-CP33_CWB的最小抑菌浓度为25-100 μg/mL。然而，Y4_CAT-CP41_CWB的抑菌效果最佳，最小抑菌浓度仅为1.6-6.3 μg/mL。

方法与材料：

通过GenScript对大肠杆菌密码子优化DNA序列，克隆到大肠杆菌表达载体pET-21a(+)的NdeI和XhoI位点，合成嗜热芽孢杆菌细胞裂解酶合成基因PlyGsPY412（基因库ACX77322，预测N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶活性，EC 3.5.1.28）、PlyGspY4（基因库ADP73474，内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性，EC 3.2.1.96）、PlyGVE2(基因库ADP73474，N-乙酰壁酰-L-丙氨酸酰胺酶活性，EC3.5.1.28)，将这些酶的CAT结构域和产气荚膜梭菌细胞裂解酶PlyCP10、PlyCP18、PlyCP33、PlyCP41和PlyCP26F的CWB结构域的DNA序列进行PCR扩增，整合到pET-21a(+)载体上，完成克隆载体的构建。

检测重组蛋白酶的裂解酶活性、热稳定性和对产气荚膜梭菌的最小抑菌浓度。抑菌试验选取的菌株有：产气荚膜梭菌菌株 Cp39、产气荚膜梭菌菌株Cp509、产气荚膜梭菌菌株Cp734、产气荚膜梭菌菌株JGS1504、产气荚膜梭菌菌株 JGS1659、蜡样芽孢杆菌菌株Bc17、粪肠球菌菌株EF-17、艰难梭菌菌株ATCC 700057、无乳链球菌、金黄色葡萄球菌菌株。

主要图表说明：

表1 产气荚膜梭菌细胞壁的肽聚糖结构和水解酶裂解位点裂解

1）葡糖胺糖苷酶在N-乙酰基氨基葡萄糖（GlcNac）和N-乙酰基尿酸（MurNac）之间切割位点。

2）胞壁质酶（溶菌酶）和裂解性转糖基酶在MurNac和GlcNac之间切割位点。

3）L-丙氨酸酰胺酶在MurNac和肽链的第一个氨基酸丙氨酸之间切割位点。

4）内肽酶在肽链中或交叉肽链间肽键切割位点。

5）细菌肽聚糖具有复杂的结构，其糖主链由N-乙酰氨基葡糖（GlcNac）和N-乙酰山梨酸（MurNac）残基的交替单元组成，并通过MurNac上的寡肽连接（肽链），寡肽通过肽桥链接。细胞裂解酶的CAT结构编码的内肽酶、糖苷酶和酰胺酶，可靶向作用肽聚糖结构中的不同；连接键裂解细胞。

图2 嗜热嵌合裂解酶重组示意图

1）PlyGsPY412、PlyGspY4、PlyGVE2提供氨基端催化域(CAT结构域)，即412_CAT、Y4_CAT、GVE2_CAT。

2）产气荚膜梭菌提供碳端结构域，即CP10_CWB、CP18_CWB、CP33_CWB、CP41_CWB和CP26F_CWB。

3）Thermophile Lysins：嗜热裂解酶；Chimeric Lysins：嵌合裂解酶；Amidase：酰胺酶；glucosaminidase: 氨基葡萄糖苷酶。

图6 嗜热芽孢杆菌细胞裂解酶合成基因Y412 _CAT，Y4 _CAT，GVE2 _CAT和融合蛋白的裂解活性

1）图A Y412 _CAT结构域与不同产气荚膜梭菌CWB结构域重组裂解酶活；图BY412 _CAT结构域与不同产气荚膜梭菌CWB结构域重组裂解酶酶活；图C GVE2 _CAT结构域与不同产气荚膜梭菌CWB结构域重组裂解酶酶活。

2）黑色：缓冲液对照组；亮蓝色：与产气荚膜梭菌CP10菌株CWB结构域融合重组裂解酶；橙色：与产气荚膜梭菌CP18菌株CWB结构域融合重组裂解酶；灰色：与产气荚膜梭菌CP33菌株CWB结构域融合重组裂解酶；黄色：与产气荚膜梭菌CP41菌株CWB结构域融合重组裂解酶；深蓝色：与产气荚膜梭菌CP26F菌株CWB结构域融合重组裂解酶。

3）横坐标：反应时间；纵坐标：吸光值（OD值），数值降低则代表产气荚膜梭菌裂解数量越多。

图7 重组嵌合裂解酶的平板裂解分析

1）重组嵌合裂解酶可有效裂解产气荚膜梭菌可裂解产气荚膜梭菌。

2）图中透明圆圈（黑色）代表重组嵌合溶菌酶裂解产气荚膜梭菌细胞。

图8裂解酶融合蛋白的热稳定性

1）重组裂解酶融合蛋白具有较好的热稳定性。

2）图A   Y412 _CAT结构域与不同产气荚膜梭菌CWB结构域重组裂解酶热稳定性；图BY412 _CAT结构域与不同产气荚膜梭菌CWB结构域重组裂解酶热稳定性；图C GVE2 _CAT结构域与不同产气荚膜梭菌CWB结构域重组细菌裂解酶热稳定性。

3）亮蓝色：与产气荚膜梭菌CP10菌株CWB结构域融合重组裂解酶；橙色：与产气荚膜梭菌CP18菌株CWB结构域融合重组裂解酶；灰色：与产气荚膜梭菌CP33菌株CWB结构域融合重组裂解酶；黄色：与产气荚膜梭菌CP41菌株CWB结构域融合重组裂解酶；深蓝色：与产气荚膜梭菌CP26F菌株CWB结构域融合重组裂解酶；绿色：产气荚膜梭菌CP18裂解酶。

3）Temperature：温度；Residual Activity：留存率。

表1 细胞裂解酶对产气荚膜梭菌菌株和其他细菌的影响

1）重组裂解酶可抑制产气荚膜梭菌的生长。

2）Lysin：细胞裂解酶；Clostridium perfringens：产气荚膜梭菌；Other Bacteria：其它菌株：Cp39：产气荚膜梭菌菌株 Cp39；Cp509：产气荚膜梭菌菌株Cp509；Cp734：产气荚膜梭菌菌株Cp734；JGS1504：产气荚膜梭菌菌株JGS1504；JGS1659：产气荚膜梭菌菌株 JGS1659、Bacillus cereus Bc17蜡样芽孢杆菌菌株Bc17、Entero-coccus faecalis EF-17:粪肠球菌菌株EF-17、Clostridium difficile ATCC 700057：艰难梭菌菌株ATCC 700057、Strepto-coccus agalactiae:无乳链球菌、Staphylo-coccus aureus 305:金黄色葡萄球菌菌株。

3)—：裂解反应速度-标准差≤5；+/—：5＜裂解反应速度-标准差≤15；+：15＜裂解反应速度-标准差≤45；++：45＜裂解反应速度-标准差≤135；+++：裂解反应速度-标准差＞135；+越多表示裂解酶对产气荚膜梭菌的裂解效果越好，抑菌作用越强。

表2 嵌合细胞裂解酶对产气荚膜梭菌菌株Cp39的最小抑菌浓度

1）Y4_CAT-CP41_CWB的抑菌效果最佳，最小抑菌浓度为1.6-6.3μg/mL。

2）Chimeric Lysin：嵌合细胞裂解酶；MIC range：最小抑菌浓度范围。

翻译：张倩玉、张罕星                          校对：林映才                          排版：张明然、刘立

如有疑问请联系：刘立13922311549